共聚焦顯微鏡是一種基于點(diǎn)照明和空間針孔濾波技術(shù)的高分辨率光學(xué)成像儀器。它通過激光掃描樣本，并利用共軛焦點(diǎn)處的針孔有效消除焦外模糊光線，從而獲取比寬場(chǎng)顯微鏡更佳的對(duì)比度與信噪比。該系統(tǒng)能逐點(diǎn)掃描并重建清晰的光學(xué)切片，實(shí)現(xiàn)樣本三維結(jié)構(gòu)的非侵入式觀測(cè)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、材料分析等領(lǐng)域，尤其適用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)研究與厚樣本的高分辨率成像。
然而，在使用過程中難免會(huì)遇到各種故障影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。掌握系統(tǒng)的故障排查方法，能夠幫助科研人員迅速恢復(fù)設(shè)備正常運(yùn)行，保障科研工作的連續(xù)性。本文將為您梳理常見故障類型及對(duì)應(yīng)的解決方案。
共聚焦顯微鏡常見故障分類及處理：
一、 圖像質(zhì)量相關(guān)問題
1. 圖像信噪比差，信號(hào)微弱
現(xiàn)象：圖像整體暗淡、顆粒感重，即使增加激光功率和增益也無法獲得清晰圖像。
可能原因及處理：
樣品制備問題：熒光染料淬滅、封片不當(dāng)或有氣泡、樣品本身信號(hào)弱。處理：檢查樣品，重新制備或更換新樣品驗(yàn)證。
物鏡不干凈：油污、灰塵等會(huì)嚴(yán)重影響光路通量。處理：用專用的鏡頭紙和清潔液小心清潔物鏡前透鏡。
激光功率過低或光路衰減過大：激光器壽命將至或?yàn)V光片設(shè)置不當(dāng)。處理：檢查軟件中的激光功率設(shè)置，確認(rèn)ND濾鏡(中性密度濾光片)是否處于關(guān)閉狀態(tài)。如懷疑激光器問題，需工程師檢測(cè)。
探測(cè)器(PMT)電壓或增益設(shè)置過低：處理：在允許范圍內(nèi)適當(dāng)提高PMT電壓或增益，但注意過高的增益會(huì)引入噪聲。
針孔孔徑過大：失去了共聚焦的優(yōu)勢(shì)。處理：確保針孔孔徑設(shè)置在最佳值(通常為1 Airy Unit左右)。
光路未準(zhǔn)直：光路發(fā)生偏移。處理：需要工程師進(jìn)行光路校準(zhǔn)。
2. 圖像背景過高
現(xiàn)象：整個(gè)視野發(fā)亮，非特異性背景信號(hào)掩蓋了目標(biāo)信號(hào)。
可能原因及處理：
非特異性染色或樣品自發(fā)熒光：處理：優(yōu)化染色流程，設(shè)置合適的陰性對(duì)照，嘗試使用抗淬滅封片劑。
二抗或染料非特異性結(jié)合：處理：在染色過程中增加封閉和洗滌步驟。
激光功率或探測(cè)器增益過高：處理：先嘗試降低PMT增益，如果信號(hào)隨之變?nèi)醯尘叭愿?，再適當(dāng)降低激光功率。
針孔孔徑過大：允許更多焦外光進(jìn)入。處理：減小針孔孔徑。
蓋玻片或物鏡上有臟污：處理：清潔蓋玻片和物鏡。
交叉對(duì)話(串色)：在多色成像時(shí)，一個(gè)通道的信號(hào)泄露到另一個(gè)通道。處理：優(yōu)化采集順序(先采集容易淬滅的通道)，或使用序列掃描而非同時(shí)掃描，并設(shè)置正確的光譜掃描范圍和分光鏡。
3. 圖像分辨率下降，模糊
現(xiàn)象：圖像細(xì)節(jié)丟失，邊緣模糊。
可能原因及處理：
樣品厚度或封片不當(dāng)：蓋玻片厚度不標(biāo)準(zhǔn)(非0.17mm)或封片劑厚度不均，導(dǎo)致球差。處理：使用標(biāo)準(zhǔn)厚度蓋玻片和合適的浸油/水，確保封片均勻。
物鏡選擇錯(cuò)誤或未校正像差：使用干鏡觀察浸液樣品，或未使用帶校正環(huán)的物鏡調(diào)節(jié)環(huán)。處理：確認(rèn)使用正確的物鏡，如有校正環(huán)，根據(jù)蓋玻片厚度和浸液類型進(jìn)行調(diào)整。
針孔孔徑過大：處理：將針孔調(diào)整到1 Airy Unit附近以獲得最佳分辨率和信噪比。
漂移：樣品或儀器本身的熱漂移或機(jī)械漂移。處理：確保樣品固定穩(wěn)定；開機(jī)后預(yù)熱系統(tǒng)30分鐘以上再采集；對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像，使用環(huán)境控制系統(tǒng)并選擇穩(wěn)定性好的載物臺(tái)。
4. 圖像中有條紋、陰影或明暗不均
現(xiàn)象：出現(xiàn)規(guī)律的掃描線、網(wǎng)格狀陰影或視野一邊亮一邊暗。
可能原因及處理：
激光束或掃描振鏡不穩(wěn)定：處理：重啟顯微鏡和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。如果問題持續(xù)，可能需要工程師校準(zhǔn)掃描頭。
電源干擾：處理：確保顯微鏡連接到穩(wěn)定的電源，并遠(yuǎn)離大功率設(shè)備。
物鏡或聚光鏡上有灰塵/纖維：處理：仔細(xì)清潔所有光學(xué)元件。
二、 硬件及機(jī)械問題
1. 無法對(duì)焦或聚焦不穩(wěn)定
現(xiàn)象：找不到焦平面，或焦距在成像過程中不斷變化。
可能原因及處理：
樣品未放平：處理：重新放置樣品，確保其與物鏡平行。
浸液使用不當(dāng)：干鏡下有浸液，或浸液中有氣泡。處理：清潔物鏡和樣品，重新添加浸液并排除氣泡。
粗準(zhǔn)焦螺旋松動(dòng)：處理：檢查并鎖緊粗準(zhǔn)焦螺旋。
Z軸驅(qū)動(dòng)器故障或校準(zhǔn)丟失：處理：需要工程師重新校準(zhǔn)Z軸驅(qū)動(dòng)單元。
2. 激光器無法打開或功率不穩(wěn)定
現(xiàn)象：軟件報(bào)激光器錯(cuò)誤，或激光功率波動(dòng)大。
可能原因及處理：
激光器達(dá)到壽命：處理：聯(lián)系工程師檢測(cè)激光器壽命，必要時(shí)更換。
激光器電源或冷卻系統(tǒng)故障：處理：切勿自行打開，立即聯(lián)系工程師。
控制軟件問題：處理：重啟計(jì)算機(jī)和顯微鏡控制系統(tǒng)。
3. 軟件無法連接硬件或控制失靈
現(xiàn)象：軟件報(bào)“硬件未找到”或“通信錯(cuò)誤”，某些功能無法控制。
可能原因及處理：
數(shù)據(jù)線松動(dòng)：處理：檢查所有連接線纜是否插緊。
軟件沖突或崩潰：處理：退出軟件，重啟計(jì)算機(jī)，再重新啟動(dòng)軟件。
驅(qū)動(dòng)程序損壞：處理：重新安裝硬件驅(qū)動(dòng)程序(需管理員權(quán)限)。
防火墻或殺毒軟件攔截：處理：將顯微鏡控制軟件加入防火墻和殺毒軟件的白名單。
日常維護(hù)與預(yù)防
定期清潔：定期用專業(yè)工具清潔物鏡、目鏡、濾光片和載物臺(tái)。
保持環(huán)境穩(wěn)定：控制實(shí)驗(yàn)室的溫度和濕度，減少振動(dòng)，保持清潔。
正確開關(guān)機(jī)：遵循規(guī)定的開關(guān)機(jī)順序，關(guān)機(jī)前確保激光器已冷卻。
規(guī)范操作：使用標(biāo)準(zhǔn)耗材，正確添加浸液，避免碰撞光學(xué)元件。
使用校準(zhǔn)樣品：定期使用熒光微球等校準(zhǔn)樣品檢查系統(tǒng)分辨率和光路準(zhǔn)直情況。
當(dāng)遇到無法解決的復(fù)雜故障時(shí)，有效的方法就是及時(shí)聯(lián)系設(shè)備制造商的技術(shù)支持工程師，并提供詳細(xì)的故障現(xiàn)象描述和您已嘗試的排查步驟。
